Neurobiologia clinica

Condividi su

Gruppo guidato da Antonio Bertolotto

Neurobiologia clinica

Il nostro gruppo di ricerca lavora a stretto contatto con il Centro di Riferimento Regionale Sclerosi Multipla - CRESM con l’obiettivo di migliorare la diagnosi, l’utilizzo dei farmaci, la definizione della prognosi della SM e l’identificazione di nuovi meccanismi patogenetici.

La sclerosi multipla (SM) è una malattia infiammatoria cronica demielinizzante del sistema nervoso centrale (SNC) e comprende uno spettro eterogeneo di sottotipi di malattia.
La peculiare diversità delle evidenze cliniche, per composizione istopatologica e immunologica, così come i differenti fenotipi neuro-radiologici presenti nella SM rappresentano una sfida diagnostica per il medico curante e richiede una particolare tipizzazione dei pazienti affetti da SM mediante l’utilizzo di biomarcatori diagnostici. Tali biomarcatori sono fondamentali al fine di anticipare il decorso della malattia e nel dare al paziente la migliore terapia efficace.

Con la prospettiva di un monitoraggio predittivo, il nostro gruppo di ricerca si propone di fornire nuovi strumenti per la gestione dei vari aspetti della SM, e quindi la possibilità di individuare procedure terapeutiche idealmente preventive. Il nostro lavoro dovrebbe inoltre contribuire a una migliore comprensione dei meccanismi fisiologici alterati nella patogenesi della SM, e definire nuovi obiettivi per futuri approcci terapeutici.

Approccio sperimentale
La nostra ricerca è mirata all’analisi molecolare e immunologica delle SM in stretta collaborazione con il gruppo di ricerca clinica e con l’ausilio di un modello murino di SM, costituito dall’encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE).

Approfittando del suo attivo e spesso principale ruolo in studi internazionali multicentrici sia di stampo terapeutico sia diagnostico sulla SM, il gruppo di ricerca clinica fornisce l’accesso a campioni biologici ben caratterizzati di pazienti affetti da SM con diverse storie cliniche e trattamenti.

Attività di diagnostica liquorale
Il laboratorio di Neurobiologia Clinica effettua alcune analisi di routine su liquido cefalorachidiano di pazienti dell’AOU San Luigi Gonzaga e per diverse Neurologie di altri centri piemontesi. Sebbene l’analisi del liquor non sia più richiesta per la diagnosi di SM, è comunque importante per fornire informazioni diagnostiche e prognostiche (confermare precocemente la diagnosi di SM e identificare i pazienti con una maggiore probabilità di sviluppare SM dopo il primo attacco clinico) e per la diagnosi differenziale con altre patologie neurologiche; inoltre è fondamentale poter disporre di campioni di liquor di pazienti con diverse patologie neurologiche per le attività di ricerca del nostro gruppo.

In particolare gli esami effettuati sono l’analisi citologica e biochimica del liquor e la rivelazione delle bande IgG oligoclonali per la valutazione della sintesi intratecale di IgG.

Attività di ricerca

L’attività di ricerca del nostro gruppo copre diversi campi:

Biomarcatori nella SM

L’identificazione di biomarcatori è un argomento di fondamentale importanza nella gestione dei pazienti con SM, dal momento della diagnosi alla gestione clinica quotidiana del paziente in trattamento. Una delle caratteristiche del nostro laboratorio è quella di ricercare e soprattutto validare biomarcatori che siano utili al neurologo nella gestione quotidiana del paziente con SM.

Biomarcatori diagnostici/prognostici
Nel corso degli anni il nostro laboratorio si è specializzato nella messa a punto e validazione di metodiche per il dosaggio di autoanticorpi legati a patologie del Sistema Nervoso Centrale che ricadono in diagnosi differenziale con la SM. In particolare sono stati messi a punto e validati saggi per il dosaggio di anticorpi anti-Acquaporina 4 (AQP4), necessari per la diagnosi di Neuromielite Ottica (NMO) e patologie ad essa correlate, conosciute con il nome di “NMO-spectrum disorders” (NMOsd): la NMO è una grave patologia autoimmune demielinizzante del SNC che colpisce il nervo ottico e il midollo spinale. Recentemente è stata messa a punto una metodica in citofluorimetria per il dosaggio degli anticorpi anti-MOG (myelin oligodendrocytic glicoprotein), che sembrano identificare una percentuale di pazienti affetti da NMOsd con prognosi migliore rispetto ai pazienti positivi agli anticorpi anti-AQP4.

E’ in corso la messa a punto di un test per il dosaggio degli anticorpi rivolti contro il canale del potassio KIR4.1, che sembrano essere presenti nel siero di una significativa percentuale di pazienti con SM: si tratterebbe del primo marcatore sierico con un valore diagnostico, importantissimo per la gestione del paziente.

La ricerca di biomarcatori per identificare gruppi di pazienti che potrebbero trarre beneficio da terapie specifiche e’ un impegno incessante della ricerca sulla SM. Poiche’ una mole crescente di dati suggerisce una forte associazione tra infezione con EBV e SM, una ipotesi da esplorare e’ che il virus stesso sia implicato nel processo disimmune che colpisce il sistema nervoso. Da queste premesse scaturisce l’idea che lo studio combinato di marcatori dell’infezione virale e dell’attivazione immunitaria possa svelare aspetti dell’interazione virus-ospite rilevanti per la SM e contribuire all’identificazione di biomarcatori con valenza prognostica.

Biomarcatori di risposta al trattamento
I biomarcatori di risposta al trattamento vengono ricercati nei pazienti che effettuano terapie farmacologiche specifiche per la SM, con lo scopo di monitorare la risposta biologica del singolo paziente al trattamento stesso, e di individuare fattori in grado di annullare tale risposta. Proteine ricombinanti omologhe di proteine umane hanno il potenziale di indurre una risposta immunogena quando usate in terapia. Alcuni farmaci attualmente usati per la SM, come IFN beta, Natalizumab e Rituximab possono indurre lo sviluppo di anticorpi anti-farmaco, in grado di abrogarne l’attività biologica e clinica. I biomarcatori di risposta al trattamento consentono di identificare precocemente i pazienti che non rispondono al trattamento o che rischiano di sviluppare gravi reazioni avverse, con lo scopo di evitare effetti collaterali al paziente e di fornire l’opportunità di una terapia alternativa e più efficace, oltre al fatto di evitare i costi associati ad una terapia inappropriata.

Uno degli obiettivi della nostra ricerca è lo studio della attività biologica dei farmaci utilizzati per la SM, e l'individuazione di nuovi marcatori biologici specifici per monitorare l'efficacia clinica e la risposta ad ogni trattamento.
Attualmente nel nostro laboratorio vengono analizzati biomarcatori di risposta alle seguenti terapie:

  • IFN beta: valutazione attività biologica attraverso il dosaggio di MxA mRNA e dosaggio anticorpi leganti e neutralizzanti il farmaco.
  • GA: valutazione attività biologica attraverso lo studio dell’induzione delle cellule T regolatorie
  • Natalizumab: dosaggio anticorpi neutralizzanti; valutazione del rischio di sviluppare la PML mediante la ricerca di anticorpi anti-JCV e l’analisi della l-selectina sui linfociti T CD4+.
  • Rituximab: dosaggio di anticorpi neutralizzanti, valutazione dell’attività biologica mediante dosaggio del farmaco circolante ed espressione del CD19 sui linfociti B.
Gravidanza

La gravidanza rappresenta uno stato fisiologico transitorio particolare in cui si ha una forte tolleranza nei confronti del feto. Nelle donne affette da SM la gravidanza ha un effetto benefico al pari del miglior trattamento presente in commercio. Ancora poco si sa sui veri meccanismi coinvolti nella patogenesi della malattia, ma è evidente che esistono delle disfunzioni a carico delle cellule del sistema immunitario. È nostro interesse valutare quali cambiamenti a livello del sistema immunitario intervengono durante la gravidanza nelle donne con SM e studiarli sia attraverso approcci molecolari sia mediante saggi a carattere cellulare. Utilizzando una vasta gamma di tecnologie molecolari e mediante analisi citofluorimetrica e saggi in vitro, cerchiamo di determinare l'interazione cellulare e i fattori molecolari, che sono modulati durante la gravidanza nelle donne con MS.

Immunopatogenesi

Un’analisi trascrizionale a livello genomico ci ha consentito di identificare un pannello di geni anti-infiammatori differentemente espressi nel sangue dei pazienti con SM rispetto ai controlli sani.  Attualmente la ricerca è volta a definire il ruolo di questi geni nella patogenesi della malattia, identificare le cause della loro deregolazione e le sottopopolazioni cellulari che ne sono maggiormente responsabili. A questo scopo ci avvarremo di tessuti ematici e cerebrali post-mortem derivanti da pazienti affetti da SM e controlli sani e di un modello murino EAE di SM.

Banca Biologica

Nonostante i notevoli investimenti nella ricerca clinica-biologica, ben pochi risultati di laboratorio sono trasformati nella progettazione di nuovi farmaci. La ricerca biologica soffre di scarsa riproducibilità dei dati pubblicati, anche in riviste prestigiose, a causa della mancanza di rigore nella raccolta di campioni biologici, della convalida insufficiente dei metodi secondo le istruzioni della FDA (Food and Drug Administration) e della condivisione limitata dei dati.

In una malattia cronica come la Sclerosi Multipla è molto difficile raccogliere campioni soprattutto perché i pazienti hanno bisogno di un attento follow-up attraverso la raccolta dei dati clinici, biologici, di neuroimaging (MRI), dei dati neurofisiologici e neuro-cognitivi. A tal proposito, il Laboratorio di Neurobiologia del CRESM ha istituito da qualche anno una BANCA BIOLOGICA che ha lo scopo di raccogliere e collezionare materiale biologico dai più di 1800 pazienti con Sclerosi Multipla seguiti presso il Centro, oltre che pazienti con altre patologie neurologiche e controlli sani.

Il materiale biologico processato e conservato secondo rigide procedure include siero, plasma, DNA, RNA e cellule oltre che Liquido Cefalorachidiano per i pazienti per i quali viene effettuata la puntura lombare. I pazienti che acconsentono di far parte della banca biologica devono firmare il Consenso Informato approvato dal Comitato Etico dell’AOU San Luigi. Tutti i dati dei campioni conservati nella banca biologica sono registrati in uno speciale database (iMED database) in cui, per ciascun paziente vengono inseriti dati clinici, biologici, neurofisiologici, di neuroimaging e test cognitivi.

Scopo della banca biologica è inoltre la distribuzione del materiale ad altri laboratori a seguito della presentazione di un progetto che viene valutato da un Comitato Scientifico. I ricercatori che ricevono i campioni dalla Banca Biologica si impegnano a fornire protocolli dettagliati dei metodi utilizzati nella loro ricerca e a fornire i dati ottenuti che potranno essere utilizzati per altri studi. Il Laboratorio del CRESM, inoltre, si impegna a fornire il supporto tecnico attraverso la co-validazione dei metodi, la replica dei dati ottenuti dai ricercatori che hanno utilizzato campioni biologici della banca biologica, la realizzazione di corsi di formazione per tecnici / biologi sui metodi biologici.

Oltretutto, questo progetto favorisce la cooperazione con altre bio-banche: da qualche tempo, infatti, la banca biologica del CRESM è stata inclusa in una rete europea di banche biologiche dedicate alla ricerca sulla SM a sull’efficacia dei nuovi trattamenti con gli anticorpi monoclonali.

Il progetto della Banca Biologica è finanziato dalla Fondazione Italiana Sclerosi Multipla (FISM) Cod. 2014/PMS/1.

Metodi:

Biologia Molecolare

  • Estrazione di acidi nucleici da cellule, tessuti, fluidi extracellulari e sangue intero
  • Real Time PCR: analisi di espressione genica, rilevamento di microRNA, genotipizzazione di SNPs

Biologia Cellulare

  • Colture e stimolazioni
  • Separazioni cellulari tramite microbiglie magnetiche
  • Analisi citofluorimetrica
  • Espressione e purificazione di proteine ricombinanti

Analisi biochimiche

  • Western Blot e immunoprecipitazione
  • Capture ELISA, bridging ELISA
  • Esame citochimico del liquid cerebrospinale
  • Saggio citopatico (per la valutazione di anticorpi anti-IFN)
  • Immunoisoelettrofocusing
  • Immunofluorescenza
  • Immunoistochimica
  • Analisi e caratterizzazione di tessuti cerebrali post-mortem di pazienti affetti da SM e controlli

Modelli murini

  • Induzione dell’EAE (MOG 35-55) utilizzando topi wild-type C57 BL6 e transgenici
  • Valutazioni cliniche e neuropatologiche
  • Analisi di espressione genica e proteica di tessuti
  • Stoccaggio di tessuti

Sostieni il lavoro di questo gruppo di ricerca
dona in modo sicuro con
ppcom